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SARS-CoV-2コロナウイルスマルチプレックスRT-qPCRキット （CD019RT）

規制ステータス：診断目的での使用ではなく、研究目的でのみ使用します。

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    概要
    ドキュメンテーション

特異性
インフルエンザAウイルス（H1N1）、インフルエンザBウイルス（山形）、呼吸器合胞体ウイルス（タイプB）、
呼吸器アデノウイルス（タイプ3、タイプ7）、パラインフルエンザウイルス（タイプ2）、マイコプラズマ肺炎、クラミジア肺炎の非特異的干渉、等
種の反応性
人間
応用
定性
サイズ
100T
ストレージ
すべての試薬は遮光して-30℃〜-15℃で保存してください。
試薬は、推奨条件で保管した場合、12か月間安定しています。
キットを開封して推奨条件で保管した場合、有効期限は変わりません。
キットをアイスパックで4日間輸送したり、凍結融解を10回行ったりしても、有効期限は変わりません。
使用目的
この製品は、2019-Novel Coronavirus（2019-nCoV）の検出を目的としています。この製品の検出結果は臨床参照用であり、臨床診断および治療の唯一の証拠として使用するべきではありません。
テストの原則
この製品は、デュアルカラーマルチプレックス蛍光プローブベースのTaqman®RT-qPCRアッセイシステムです。 Taqman蛍光プローブは、レポーター-クエンチャーメカニズムに基づく特定のオリゴヌクレオチドです。各プローブについて、5 '末端はフルオロフォアで標識されていますが、3'末端はクエンチャーで標識されています。プローブが無傷の場合、フルオロフォアが発する蛍光は消光剤に吸収され、蛍光シグナルは検出されません。ただし、テンプレートの増幅中は、Taq DNAポリメラーゼの5'-3 'エキソヌクレアーゼ活性によりプローブが分解され、蛍光レポーターとクエンチャーが切断されて分離されるため、蛍光シグナルを検出できます。各分子単位複製配列の生成は、蛍光シグナルの生成を伴います。蛍光シグナルの蓄積を監視することにより、PCRプロセス全体のリアルタイム監視を評価できます。
この製品は、1つのチューブで2019-nCoVの2つの独立した遺伝子のデュアル検出を提供します。特定のプライマーとプローブは、2019-nCoVのORF1ab遺伝子とN遺伝子の保存領域をそれぞれ検出するように設計されており、SARS2003とBatSARSのようなウイルス株の非特異的な干渉を回避しています。
検出限界
500コピー/ mL。
提供される試薬と材料
1.バッファー、dNTP、プライマー、プローブを含む検出バッファー（900μL×2チューブ）。
2.酵素ミックス（200μL×1チューブ）、RNase阻害剤、UDG、逆転写酵素、Taq DNAポリメラーゼを含む。
3.ポジティブコントロール（200μL×1チューブ）、ターゲットフラグメントを含むプラスミド。
4.陰性対照（500μL×1チューブ）、DEPC処理水。
注：検出用に異なるバッチのコンポーネントを混合しないでください。
必要な資料が提供されていない

ABI7500、ABI Q3、ABI Q6、Roche LightCycler480、Bio-Rad CFX96など、FAMチャネルとTEXAS REDチャネルの両方を備えたリアルタイムPCR機器。
標本の収集と準備
1.適切な検体の種類：上気道検体（鼻腔スワブ、鼻咽頭スワブ/吸引液/洗浄液、および痰を含む）および下気道検体（呼吸液、気管支洗浄液、気管支肺胞洗浄液、および肺生検検体を含む）。
2.検体採取の詳細な方法については、「微生物学検体採取マニュアル」のプロトコルを参照してください。
3.採取した検体は、同日内の検出に使用してください。それ以外の場合は、標本を次のように保管してください
。2°C〜8°Cで24時間以内で保管してください。
-20°C未満で10日間保管してください。
凍結融解を繰り返さないようにして、-70°C未満で長期間保存します。
4.標本は、ドライアイスを入れた密閉発泡ボックスを使用して輸送する必要があります。
標本の準備
サンプルは、ウイルスRNA抽出キットの対応する要件と手順に従って抽出する必要があります。抽出されたRNAは直接検出に使用できます。抽出したRNAをすぐに検出に使用しない場合は、凍結融解を繰り返さないように-70℃以下で保存してください。
試薬の準備
必要な試薬を解凍し、振とうして混合し、使用前に軽く遠心します。次のように、RNaseフリーの遠心チューブで混合物を準備します。

注：各テストでネガティブコントロールとポジティブコントロールの両方を設定することをお勧めします。
上記の混合物を完全に混合し、20μLのアリコートを異なるPCR反応チューブに入れます。次に、標本準備エリアに移動します。
アッセイ手順
1.テンプレートの追加（検体準備エリア）
5μLの陰性コントロール（抽出は不要）、5μLの陽性コントロール（抽出は不要）、および検体からの5μLの抽出RNAを、20μLの異なるPCR反応チューブに追加します。PCRミックス。
2. RT-PCR増幅（検出エリア）
PCR機器に反応チューブを置き、次のサイクリングプロトコルをセットアップして実行します。

検出蛍光の設定：ORF1ab遺伝子（FAM）、N遺伝子（TEXAS RED / ROX）。機器の蛍光の内部参照パラメータを「なし」に設定してください。例：ABIシリーズ機器の場合、「パッシブリファレンス」を「なし」に設定してください。
3.データ分析（機器のユーザーマニュアルを参照）
例としてABI7500を取り上げます。qPCR反応後、結果は自動的に保存されました。分析した画像に
応じて、ベースラインの開始値、終了値、しきい値を調整してください（開始値：3〜15;終了値：5〜20;しきい値はログウィンドウで設定でき、しきい値ライン増幅曲線の指数フェーズにある必要があります;陰性対照の増幅曲線はまっすぐであるか、またはしきい値線より下でなければなりません）。「分析」をクリックすると自動的に分析結果が得られ、「レポート」ウィンドウで検出結果を確認できます。
品質管理

上記のすべての基準が満たされた場合、結果は有効です。それ以外の場合、結果は無効です。
結果の解釈
品質管理の基準が満たされている場合、サンプルのデータを次のように分析します。
精度
高および低の肯定的な品質の製品の2つのケースを使用して10回連続してテストすると、Ct値のCVは5％以下です。
予防
1.実験を始める前に本書をよくお読みになり、指示に従ってください。
2.この製品は、安全が保護された実験室で訓練を受けた労働者のみが使用し、適切な保護具を着用してください。
3.この製品は光から保護する必要があります。検出時には無菌、DNasefree、およびRNase-freeのチューブとチップを使用してください。
4.この製品のテストされた検体は感染性物質と見なされます。操作と治療は、地域の規制と法律の要件を満たす必要があります。
制限事項
1.この製品の検出結果は臨床参照用であり、臨床診断および治療の唯一の証拠として使用するべきではありません。患者の臨床管理は、症状/徴候、病歴、他の臨床検査および治療反応と組み合わせて検討する必要があります。検出結果は臨床診断のエビデンスとして直接使用するべきではなく、臨床医の参照のみを目的としています。
2.検出結果は、検体の採取、保管、輸送などの運用に影響を受ける場合があります。操作に誤りがあると偽陰性の結果となる場合があります。検体処理中の相互汚染は、偽陽性の結果につながる可能性があります。
3.この製品の検出されたターゲット配列は、2019-nCoVのORF1ab遺伝子とN遺伝子の保存領域です。ただし、ターゲットシーケンスのバリエーションは、偽陰性の結果につながる可能性があります。